Главная » 2014»Июль»24 » Скачать Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью бесплатно
2:55 AM
Скачать Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью бесплатно
Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения
Диссертация
Автор: Куликов, Александр Викторович
Название: Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения
Справка: Куликов, Александр Викторович. Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения : диссертация доктора биологических наук : 03.00.15 Новосибирск, 2005 216 c. : 71 06-3/63
Объем: 216 стр.
Информация: Новосибирск, 2005
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ СЕРОТОНИНОВАЯ СИСТЕМА
МОЗГА И ЗАЩИТНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
11 Общие представления о серотонииовой системе мозга млекопитающих
12 Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотопина
Генетическая регуляция активности ТПГ
13 Генетические и молекулярные основы серотониновой регуляции защитного поведения
131 Основные подходы к анализу наследования поведения
132 Межсамцовая агрессия
123 Агрессия по отношению к человеку
134 Реакция активного избегания
135 Реакция замирания (каталепсия)
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Животные
211 Условия содержания экспериментальных животных
212 Гибридологических анализ
22 Поведенческие тесты
221 Межсамцовая агрессия мышей
222 Тестирование животных на выраженность каталепсии
223 Тревожность у крыс
23 Определение активности ТПГ в мозге
231 Флюориметрическийметод
232 Определение активности ТПГ с помощью жидкостной хроматографии высокого давления
24 Молекулярнобиологические методы
241 Выделение геномной ДНК
242 Выявление C1473G полиморфизма в гене tph2 мышей
243 ПЦР с полиморфными микросателлитными маркерами
25 Статистическая оценка полученных данных
251 Проверка гипотезы о моногеппом наследовании
252 Проверка гипотезы о сцеплении альтернативных признаков с неполной пенетрантностъю
ГЛАВА 3 ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АКТИВНОСТИ ТПГ В МОЗГЕ МЫШЕЙ
31 Межлинейные различия в активности ТПГ
32 Гибридологический анализ наследования активности ТПГ в мозге
33 Ассоциация С14730 полиморфизма в 11-ом экзоне гена 1рН2 с активностью ТПГ в мозге мышей
34 Роль обратимого фосфорилирования в определении наследственных различий в активности ТПГ в головном мозге мышей
Введение:
Актуальной проблемой генетики поведения, нейрогенетики и нейробиологии является изучение молекулярного механизма развертывания информации, записанной в молекуле ДНК, в сложный поведенческий признак (Гейто, 1969; Бензер, 1975; Попомаренко и др., 1975; Пономаренко, Лопатина, 1981; Ван Абилен, 1981; Фогель, 1981; Vogel, Motulsky, 1982; Полетаева, Романова, 1991; Crabbe, 1999; McCIearn, 1999; Boguski, Jones, 2004). В настоящее время пе вызывает сомнения ключевая роль медиаторов головного мозга в регуляции поведения животных и человека в норме и патологии. Одним из классических медиаторов является серотонин (5-гидрокситриптамип). Серотониновые нейроны лидируют по числу синаптических контактов (Audet et al., 1989; Jacobs, Azmitia, 1992). Кроме того, медиатор действует на 14 различных типов рецепторов, сопряжеппых со всеми основными механизмами внутриклеточной трансдукции сигнала (Saudou, Hen, 1994; Barnes, Sharp, 1999). Эти два фактора определяют удивительную полифупкциопальность серотонина - способность его контролировать большое количество различных процессов в ЦНС и форм поведения (Saudou, Hen, 1994; Попова, Куликов, 2003). С помощью фармакологических методов показано участие серотониновой системы в регуляции агрессивного, полового, пищевого и других форм поведения (обзоры Попова и др., 1978; Jacobs, Azmitia, 1992; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998; Popova, Amstislavskaya, 2002a,b). Интерес к серотониновой системе мозга обусловлен еще и тем, что трансмембрапный транспортер серотонина (Blakely et al., 1994, 1998; Blakely, 2001; Horschitz et al., 2001) и рецепторы 5-HT,A и 5-HT2A типов (Gardner, 1988; Deakin, 1991; Lucki et al., 1994; Stahl, 1994; Blier, de Montigny, 1994; Kunovac, Stahl, 1995; Eison, Mulins, 1996; Barnes, Sharp, 1999; Pineyro, Blier, 1999; Попова, Куликов, 2003) вовлечены в молекулярный механизм действия многих антидепрессантов и анксиолитиков.
Ключевым ферментом биосинтеза серотонина является триптофангидроксилаза (ТПГ), катализирующая гидроксилирование триптофана в 5-гидрокситриптофан, -первую и лимитирующую стадию биосинтеза медиатора (Green, Sayer, 1966; Gal, 1974; Fitzpatrick, 1999).
В 2003 году было показано существование двух изоформ ТПГ - ТПГ-1 и ТПГ-2, которые кодируются генами tphl и tph2 (Walther et al., 2003). Первая изоформа, кодируемая геном tphl, клонированным и секвенированным Grenett et al.(1987), экспрессируется только в периферических тканях, эпифизе и тучных клетках (Walther et al., 2003). В мозге синтез серотонина осуществляется второй изоформой фермента, ТПГ-2 (Walther et al., 2003; Zhang et al., 2004).
Открытый в 2004 году ген tph2 сразу же стал предметом интенсивного изучения. Обнаружено около 25 мутаций гена tph2 человека и показана ассоциация некоторых из этих мутаций с предрасположенностью к аффективным психозам (Breidenthal et al., 2004; De Luca et al., 2004; Harvey et al., 2004; Zill et al., 2004a, 2004b; Zhang et al., 2005). Однако до настоящего времени связь этих мутаций с активностью ТПГ в мозге установлена не была.
Основным механизмом регуляции активности ТПГ в мозге является обратимое фосфорилирование молекул фермента, катализируемое кальций, кальмодулин-зависимой протеинкиназой II в присутствии Ca (Hamon et al., 1976; 1978; Kuhn et al., 1978; Boadle-Biber, 1982a; Kuhn, Lovenberg, 1982).
Несмотря на ключевую роль ТПГ в биосинтезе серотонина и в механизме передачи сигнала в серотониновом синапсе и на постулируемую связь изменений активности фермента с наследственными изменениями (и нарушениями) поведения, очень мало было известно о генетическом контроле активности фермента в мозге. Имеющиеся публикации демонстрируют только наличие межлипейпых различий в активности фермента у мышей (Barchas et al., 1974; Diez et al., 1976b; Natali et al., 1980; Knapp et al., 1981). На момент начала наших исследований не было данных о межлинейных различиях активности ТПГ в мозге крыс.
Ген, кодирующий ТПГ в мозге, традиционно рассматривается как ген-кандидат, вовлеченный в регуляцию поведения и психики (Nielsen et al., 1994; 1997; Veenstra-VanderWeele et al., 2000; Gingrich, Hen, 2001, De Luca et al., 2004; Zill et al., 2004a,b; Zhang et al., 2005).
Особое внимание привлекает возможная ассоциация ТПГ е выраженностью защитного поведения. Защитное поведение представляет собой комплекс эволюциопно закрепленных врожденных реакций на неодушевленные и одушевленные угрожающие стимулы внешней среды. Можно выделить такие разновидности защитного поведения как защита территории (или социального статуса в группе), оборонительная агрессия по отношению к хищнику, реакция активного избегания и реакция замирания (затаивание) (Попова, 1997; Dixon, 1998; Popova, 1999; Попова, 2004).
Имеются генетические модели для изучения генетико-молекулярных механизмов регуляции различных форм защитного поведения. Межсамцовую агрессию традиционно изучают па линейных мышах и гибридах (Maxson, 1992; 1999). Для изучения наследственных механизмов агрессии на человека были созданы две модели доместикации - на серебристо-черных лисицах (Трут, 1978; 1981) и серых крысах-пасюках (Беляев, Бородин, 1982; Никулина и др., 1985а). Классической моделью изучения реакции активного избегания являются Римские линии крыс RHA и RLA, различающиеся по выраженности реакции активного избегания в челночной камере (Overstreet, 1992). Наконец, для исследования генетического контроля реакции замирания (каталепсии) была создана линия крыс ГК (Колпаков, 1990; Kolpakov et al., 1996). Другой моделью естественной каталепсии является щипковая (pinch-induced) каталепсия мышей (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981).
В то же время связь между активностью ТПГ и наследственным разнообразием по выраженности этих форм защитного поведения исследована не была.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования было изучение закономерностей генетического контроля активности ТПГ в мозге и выяснение роли фермента в генетическом и молекулярном механизмах регуляции выраженности различных форм защитного поведения.
Были поставлены следующие задачи:
1. Изучить закономерности генетического контроля активности ТПГ в мозге мышей.
2. Исследовать генетический контроль межсамцовой агрессии у мышей и связь межсамцовой агрессии с активностью ТПГ в мозге.
3. Проанализировать участие ТПГ в процессе доместикации серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков.
4. Исследовать роль ТПГ мозга в механизме регуляции генетически детерминированных различий в проявлении реакции активного избегания у крыс.
5. Изучить генетический контроль каталепсии мышей.
6. Выяснить связь ТПГ с наследственно детерминированными различиями в предрасположенности к каталепсии мышей и крыс.
Научная новизна. Были выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге мышей: конститутивиый и регуляторный. Конститутивная изменчивость обусловлена C1473G полиморфизмом в 11-ом экзопе гена tph2, а регуляторная изменчивость - наследственным полиморфизмом по степени фосфорилирования фермента.
Выявлена ассоциация интенсивности драк с полиморфизмом С1473в в гене 1рк2 мышей. Интенсивность драк была снижена у мышей с генотипом 14730/0 по сравнению с животными 1473С/С.
Установлено увеличение активности ТПГ в среднем мозге серебристо-черных лисиц и крыс-пасюков в процессе доместикации.
Выявлена ассоциация слабой выраженности реакции активного избегания со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге крыс.
Показана связь наследственной предрасположенности к каталепсии с повышенной активностью ТПГ в' стриатуме мышей и крыс.
Ген, определяющий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13 мыши.
Теоретическая значимость работы. Основным вкладом данного исследования в генетику и нейрогеномику поведения является экспериментальное доказательство генетической ассоциации активности ТПГ в мозге с наследственно детерминированным полиморфизмом по выраженности различных форм защитного поведения. Другим важнейшим теоретическим положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство того, что в основе селекции по поведению лежит отбор генетических факторов, регулирующих активность ТПГ в головном мозге.
Показано существование связанной с геном 1рЪ2 (конститутивной) и не связанной с ним (регуляторной) изменчивости активности ТПГ в мозге.
Установлена связь конститутивной и регуляторной изменчивости с наследственным полиморфизмом основных типов защитного поведения.
Выявление ассоциации С14730 полиморфизма в гене 1рЬ2 с интенсивностью драк у самцов мышей имеет существенное эвристическое значение для понимания молекулярно-генетического механизма регуляции агрессии и жестокости.
Практическая значимость работы. Показана ассоциация наследственно детерминированных особенностей агрессии на человека, активного избегания и каталепсии с регуляторной, но не конститутивной изменчивостью ТПГ в мозге. Полученные данные указывают на существенную роль генов, контролирующих посттрансляционную модификацию ТПГ, в регуляции наследственного полиморфизма по выраженности этих форм защитного поведения.
У мышей линии СВА выявлена чрезвычайно высокая предрасположенность к щипковой каталепсии. Эта линия может использоваться как модель для изучения гепетико-молекулярных механизмов естественной защитной реакции замирания.
Разработан чувствительный флуориметрический метод измерения активности ТПГ в тканях.
Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные основы регуляции поведения», читаемом для студентов кафедры физиологии Новосибирского Государственного университета.
Положения, выносимые на защиту.
1. Выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге: конститутивный и регуляторпый. Конститутивная изменчивость обусловлена С1473в полиморфизмом в 11-ом экзоне гена /р/г2, кодирующего ТПГ. Регуляторная изменчивость связана с различиями в механизме обратимого фосфорилировапии уже синтезированных молекул фермента.
2. Активность ТПГ в мозге ассоциирована с наследственной изменчивостью по выраженности различных форм защитного поведения у разных видов животных. Конститутивная изменчивость активности фермента ассоциирована с интенсивностью межсамцовой агрессии мышей. Регуляторная изменчивость - с выраженностью агрессии на человека, реакцией активного избегания и каталепсией.
3. Изменчивость порога (уровня, предрасположенности) и интенсивности (числа драк) межсамцовой агрессии мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Однако эти два показателя межсамцовой агрессии регулируются разными генетическими механизмами. В то время как доминирует низкий порог агрессивной реакции, интенсивность драк имеет промежуточный тип наследования. Обнаружена ассоциация числа драк между самцами мышей с полиморфизмом С14730 в гене /р/г2.
4. Селекция серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков на отсутствие агрессии на человека (доместикация) приводит к сходному увеличению активности ТПГ в среднем мозге.
5. Наследственно детерминированное отсутствие реакции активного избегания у крыс линии 11ЬА ассоциировано со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге.
6. Предрасположенность к реакции замирания (каталепсии) у мышей контролируется в основном геном, локализованным в дистальном фрагменте хромосомы 13.
7. Наследственная каталепсия у мышей каталептической линии СВА и крыс линии ГК, селекционированной па каталепсию, сопровождается локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Ученых Сессиях Института цитологии и генетики в 1988, 1991, 2000, 2003 годах, 1 Всесоюзной конференции "Химия, биохимия и фармакология производных индола" (Тбилиси, 1986), Всесоюзной конференции «Медиаторы в генетической регуляции поведения» (Новосибирск, 1986), XV съезде Всесоюзного физиологического Общества им. И.П. Павлова, (Ленинград, 1987), 5 Съезде ВОГИС (Москва, 1987), конференции "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988), 3 школе-семинаре по генетике и селекции животных (Бийск, 1989), Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Новый Орлеан, 11993 , США), 4 Международной конференции Общества Нейробиологии Поведения (Сантьяго де Компостела, Испания, 1995), XIX съезде Российского физиологического Общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004) и на конференции Российского нейрохимического общества «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005).
Публикации. Материал диссертации изложен в 54 публикациях в отечественных (31) и международных (23) реферируемых журналах.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своим соавторам д.б.н. В.Г. Колпакову, к.б.н. H.H. Барыкиной, к.б.н. Т.А. Алехиной (лаб. эволюционной генетики Института цитологии и генетики), Drs. F. Chaouloff, М.-Р. Moisan и Р. Mormede (INSERM, U471, Франция), а также старшим лаборантам В.И. Ребрик, Т.Ф. Денисовой (лаб. нейрогепомики поведения Института цитологии и генетики) и Т.А. Голдобиной (лаб. разведения животных Института цитологии и генетики) за помощь в проведении ряда экспериментов и получении материала.
