Главная » 2014»Сентябрь»19 » Скачать Стимуляция ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах с помощью транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы. бесплатно
5:42 AM
Скачать Стимуляция ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах с помощью транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы. бесплатно
Стимуляция ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах с помощью транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы
Диссертация
Автор: Цоколаева, Зоя Ивановна
Название: Стимуляция ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах с помощью транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы
Справка: Цоколаева, Зоя Ивановна. Стимуляция ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах с помощью транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04, 03.00.13 Москва, 2006 140 c. : 61 06-3/834
Объем: 140 стр.
Информация: Москва, 2006
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Концепция образования и развития сосудистой сети
11 Васкулогенез
12 Ангиогенез 9 121 Гипоксия - механизм запуска ангиогенеза 9 122 Фазы ангиогенеза 10 123 Ангиогенные факторы
13 Артериогенез
2 Сосудистый эндотелиальный фактор роста [УЕвЕ] - основной регулятор ангиогенеза
3 Урокиназа в ремоделировании сосудов и ангиогенезе
31 Ангиогенез, внеклеточный протеолиз и урокиназа
32 Структура урокиназы
33 Рецептор урокиназы
34 Ингибиторы активаторов плазминогена
35 Функции урокиназы
36 Урокиназы в ремоделировании сосудов
37 Урокиназы в ангиогенезе
4 Терапевтический ангиогенез 33 41 Генная терапия для терапевтического ангиогенеза
411 Методы генетической трансфекции в генной терапии
412 Основные векторные системы
5 Способы доставки генетического матириала и рекомбинантных ангиогенных факторов в миокард и скелетные мышцы
6Доклинические исследования по терапевтическому ангиогенезу
7 Клинические испытания по терапевтическому ангиогенезу 48 Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы
1 Культура клеток
11 Выделение эпдотелиальных клеток
12 Культивирование клеток
13 Культивирование эндотелиальных клеток в условиях гипоксии
14 Оценка формирования тубулярных структур эндотелиальными клетками
15 Определение пролиферации эндотелиальных клеток 58 2Модели сердечно-сосудистой патологии у животных и морфологический анализ
21 Модель инфаркта миокарда у крысы и внутримиокардиальное введение растворов плазмид
22 Модели ишемии задней конечности крысы и мыши и внутримышечное введение растворов плазмид 60 23 Подготовка тканей сердца и мышц 61 231 Выделение и препаровка сердца 61 232 Подготовка мышечной ткани
24 Иммуногистохимическое выявление кровеносных сосудов в образцах миокарда и скелетных мышц
25 Подсчёт сосудов
26 Оценка инфильтрации периинфарктной зоны макрофагами
27 Определение размера инфаркта
28 Анализ востановления кровотока в ишемизированной конечности мыши
29 Оценка развития отека мышц задней конечности после введения плазмид 65 2Биохимические и молекулярно-биологические методы анализа
31 Выделение мембран эндотелиальных клеток
32 Определение активности аденилатциклазы в препаратах мембран эндотелиальных клеток
33 Конструирование плазмид
34 Трансфекция клеток
35 Иммуноферментный анализ содержания урокиназы и УБвР в клетках и среде культивирования
36 Оценка уровня экспрессии бета-галактозидазы
37 Выделение РНК из культивируемых клеток и образцов тканей
38 Полуколичественный ПЦР
39 ПЦР в реальном времени
ЗЛО Определение концентрации белка в пробах
311 Электрофорез белков и иммуноблоттинг
4 Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1 Влияние гипоксии на экспрессию и секрецию урокиназы эндотелиальными клетками
11 Влияние гипоксии на содержание урокиназы в среде культивирования эндотелиальных клеток
12 Влияние гипоксии на содержание белка и мРНК урокиназы в эндотелиальных клетках
13 Экспрессия рецептора урокиназы в условиях гипоксии
14 Влияние гипоксии на активность аденилатциклазы в эндотелиальных клетках
2 Динамика экспрессии эндогенной урокиназы в ишемизированном миокарде крысы
3 Получение плазмидных конструкций, содержащих кДНК урокиназы и фактора роста сосудистого эндотелия (УЕвР) и проверка их функциональной активности
31 Конструирование плазмид
32 Проверка функциональной активности плазмид
321 Активность бета-галактозидазы в транфицированных клетках
322 Продукция белков фактора роста эндотелия сосудов и урокиназы в транфицированных клетках
333 Определение экспрессии УЕСР-165 по его биологической активности
4 Оценка эффективности трансфекции миокарда и скелетных мышц при прямом введении плазмид
41 Эффективность трансфекции скелетных мышц и миокарда при использовании внутримышечного/внутримиокардиального введения плазмидных конструкций
42 Динамика экспрессии трансгенов - урокиназы и УЕвР человека -в сердце крысы после введения соответствующих плазмид
5 Влияние трансгенной экспрессии урокиназы на ангиоартериогенез в периинфарктной зоне сердца крысы
51 Количество сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами урокиназы и УЕвЕ
52 Размера инфаркта при введении генов иРА и УЕвЕ в периинфарктную зону сердца крысы
53 Инфильтрация периинфарктной зоны моноцитами/макрофагами после ведения плазмид с генами урокиназы и УЕвЕ 92 6 Влияние трансгенной экспрессии урокиназы на ангиогенез в ишемизированной задней конечности крысы и мыши 61 Количество капилляров в ишемизированных мышцах задней конечности крысы после введения плазмид с генами урокиназы и
62 Восстановление кровотока и ангиогенез в ишемизированной конечности мыши после трансгенной экспрессии урокиназы и УЕвЕ
63Развитие отека мышц при введении плазмид с генами урокиназы и УЕвЕ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Введение:
Ишемические заболевания сердца и нижних конечностей, возникающие вследствие стенозирующего поражения сосудов, входят в ряд наиболее распространенных причин инвалидизации и смертности населения развитых стран. Несмотря на внедрение эффективных методов медикаментозного лечения, хирургической и эндоваскулярной реваскуляризации, остается значительная часть больных, неподходящих для лечения этими методами или у которых с помощью этих методов удается лишь частично восстановить кровоснабжения тканей.
Раскрытие механизмов, регулирующих рост и ремоделирование сосудов, позволило разработать новую тактику лечения больных, основанную на введении в ишемизированные ткани ангиогенных факторов роста в виде рекомбинантных белков или генетических конструкций для стимуляции прорастания сосудов и улучшения их кровоснабжения и функции. Позже с этой целью стали использовать стволовые и прогениторные клетки. Эта тактика получила название терапевтический ангиогенез [H?ckel М et.al.1993, Arras М., 1998, Yia-Herttuala S.,2000, Asahara Т,2002].
Для стимуляции ангиогенеза с помощью генной терапии используются гены ростовых факторов, которые в подавляющем большинстве являются секретируемыми белками. Большое число экспериментальных данных свидетельствует о том, что даже непродолжительная трансгенная гиперэкспрессия таких факторов роста в ограниченном числе клеток ткани приводит к возрастанию их продукции, достаточному для стимуляции роста сосудов [Takeshita S et.al.l994;Lewis B.S., 1997; Schwarz Е. et.al.2000 Yia-Herttuala S.,2000 ].
В исследованиях на животных и в неконтролируемых клинических испытаниях по введению в ишемизированные ткани факторов роста или их генов были получены очень обнадеживающие результаты позволяющие надеяться, что ишемию миокарда и нижних конечностей таким способом можно лечить [Isner J. Et.al.1996; Losordo D.et.al.1998; Yia-Herttuala S.,2000]. Однако в большинстве недавно завершенных плацебо контролируемых двойных слепых испытаниях не было получено бесспорных доказательств эффективности лечения ишемии с помощью рекомбинантных белков или генов факторов роста [Yia-Herttuala S. et.al.2004; Grines С et.al.2003; Kastrup J. et.al.2005]. Возможными причинами неудачи считаются использование одного фактора для стимуляции такого сложного и многоступенчатого процесса как ангиогенез, кратковременное действие ангиогенного фактора, неадекватные дозы и способы введения.
В связи с этим особую актуальность приобретает поиск оптимальных сочетаний ангиогенных факторов и новых факторов с полифункциональной активностью.
Запуск образования новых сосудов происходит в тканях при увеличении экспрессии факторов роста, прежде всего VEGF, стимулирующего пролиферацию и миграцию эпдотелиальных клеток, увеличивающего сосудистую проницаемость. Экспрессия этого фактора и рецепторов к нему, а также ряда других ангиогенных факторов регулируется на уровне транскрипции в условиях гипоксии [Cormier-Regard.S.1998, Feldser D 1999, Tazuke SI, 1998, Semenza GL 2000, M Leel 2003]. Однако, одного только увеличения экспрессии факторов роста, недостаточно ни для запуска ангиогенеза, ни для ремоделирования сосудов в ходе адаптивного артериогенеза. Многие факторы роста связываются с белками межклеточного матрикса, что снижает концентрацию свободного белка, способного связаться с рецепторами на клеточной поверхности, а некоторые из факторов секретируются клетками в неактивном состоянии и затем подвергаются протеолитической активации [Creemers Е 2000, Ducharme А. 2000, Plouet J.1997]. Помимо этого, для процесса неоваскуляризации необходимо разрушение связей между эндотелиальными клетками, базальной мембраны и внеклеточного матрикса, чтобы освободить клетки и пространство для их миграции и пролиферации, экстравазации моноцитов, обеспечивающих рост сосудов [Carmeliet Р. et.al.2000, Rakesh К Jain. 2003].
Ключевым регулятором внеклеточного протеолиза, запускающим каскад протеолитических реакций на поверхности клетки, обеспечивающим образование и рост сосудов, является урокиназный активатор плазминогена или урокиназа (иРА). Связываясь со специфическим рецептором на клеточной мембране, урокиназа активирует плазмин в строго определенных участках поверхности клетки, который в свою очередь активирует матриксные металлопротеазы, разрушающие основные белки внеклеточного матрикса, обеспечивая пространство для движения клетки [Blasi F, 1999; Bobik A.,Tkachuk V., 2003, Jianqiang Yu., 2004]. Помимо этого протеазы активируют и высвобождают из матрикса большинство ангиогенных факторов, необходимых для пролиферации, миграции и инвазии клеток [Jianqiang Yu., 2004, Naldini L. et.al.1992; Plouet J.1997, Luttun A, 2000]. И, наконец, урокиназа, взаимодействуя со своим рецептором и другими белками на поверхности клетки, модулирует внутриклеточную сигнализацию, обеспечивающую направленное движение клетки [Dumler I. et.al.1999; Степанова
В.В., Ткачук В.А.,2002]. Урокиназа стимулирует развитие стенозов артерий после экспериментальной ангиопластики за счет стимуляции пролиферации и миграции гладком ышечных клеток медии и клеток неоинтимы, привлечения моноцитов/макрофагов в сосудистую стенку[Р1екЬапоуа О. et.al.2001; Parfyonova Ye.et.al. 2004]. Большинство из этих процессов ответственны и за развитие адаптивного артериогенеза при ишемии тканей. Прямые доказательства важной роли урокиназы в ангиогенезе получены в работах на трансгенных мышах, нокаутированных по гену урокиназы. У них подавлен артериогенез при ишемии задних конечностей [Ретс11, et.al.2003], а УБвР не способен стимулировать ангиогенез в периинфарктной зоне сердца, в то время как у диких мышей он оказывает выраженный ангиогенный эффект [Неушапз е1 а1., 1999]. Эти данные свидетельствуют о том, что урокиназа - необходимый посредник ангиогенных эффектов факторов роста. Мы полагаем, что увеличение синтеза урокиназы в зоне ишемии могло бы стимулировать ангиогенез и усиливать эффекты факторов роста. Для проверки этой гипотезы мы исследовали влияние транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы на ангио-артериогенез в периинфрктной зоне сердца крысы и в ишемизированной задней конечности крысы и мыши.
Целью работы было изучение возможности стимуляции неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью прямого введения в них плазмид с кДНК урокиназы на моделях ишемии скелетных мышц и миокарда у животных.
В рамках реализации этой цели были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:
1. Изучить влияние гипоксии на экспрессию и продукцию урокиназы эндотелиальными клетками человека и накопление урокиназы в среде культивирования этих клеток.
2. Исследовать динамику экспрессии урокиназы в ишемизированном миокарде периинфарктной зоны сердца крысы
3. Сконструировать плазмидныс векторы, несущие кДНК человеческой, мышиной и крысиной урокиназы, человеческого УЕвЕ и маркерного гена бета-галактозидазы. Исследовать функциональную активность получеппых плазмид на культурах клеток.
4. Исследовать эффективность трансфекции скелетных мышц и миокарда при прямом введении плазмиды с маркерным геном бета-галактозидазы; оценить длительность экспрессии трансгепов в ишемизированном миокарде крысы с помощью вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР.
5. Изучить влияние прямого внутримиокардиального введения плазмид с кДНК урокиназы на ангио- артериогеиез в периинфарктной зоне и размер инфаркта миокарда у крысы.
6. Изучить влияние прямого внутримышечного введения плазмид с кДНК урокиназы на ангиогенез и восстановление кровотока в ишемизированной задней конечности крысы и мыши, сравнить с эффектом УЕвЕ и оценить эффект совместного введения двух генов [урокиназы и УЕвЕ]; оценить влияние генной терапии на развитие отека конечности.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В работе было впервые показано, что трансгенная экспрессия урокиназы в ишемизированных скелетных мышцах и миокарде путем прямого введения плазмид несущих кДНК урокиназы стимулирует ангио-артериогенез и ускоряет восстановление кровотока в ишемизированных тканях. В отличие от УЕвР она не вызывает развития отека тканей в месте введения. Совместное использование генов урокиназы и УЕОР позволяет снизить дозу УЕОР без потери эффективности.
Полученные данные указывают на урокиназу как на новый перспективный терапевтический геи для стимуляции ангио- артериогенеза в ишемизированных тканях.
