Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа
Диссертация
Автор: Штыря, Юлия Александровна
Название: Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа
Справка: Штыря, Юлия Александровна. Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 / Штыря Юлия Александровна; [Место защиты: Ин-т биоорган. химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 143 с. ил. Москва, 2009 143 c. :
Объем: 143 стр.
Информация: Москва, 2009
Содержание:
Список использованных сокращений
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 21 Вирус гриппа
22Классификация нейраминидаз
23Структура нейраминидаз
231 Цитоплазматический участок
232 Трансмембранный домен
233 Стебель
234 Голова
235 Гликозилирование
24Строение каталитического центра
25Механизм реакции
26Ингибиторы нейраминидаз
261 Мутации в NA, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам NA
262 Мутации в НА, возникающие под действием ингибиторов NA
263 Современная ситуация с возникновением резистентных штаммов вируса гриппа
27Определение активности и специфичности нейраминидазы вируса гриппа
271 Определение активности
272 Изучение субстратной специфичности
273 Известные литературные данные об олигосахаридной специфичности NA вирусов гриппа
28Корреляция активностей гемагглютинина и нейраминидазы
281 Восстановление функционального баланса вреассортантных вариантах 53 29 Восстановление функционального баланса при дефектах вируса гриппа
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70 41Метод определения активности и специфичности нейраминидаз с помощью BODIPY-меченых олигосахаридов
42Определение активности NA вируса гриппа
43Влияние вирусных белков на действие нейраминидазы
431 Удаление NA с вирусной частицы Сравнение свободной и вирус-связанной нейраминидазы
432 Изменние типа гемагглютинина и М-белка
44Влияние хранения вакцинных штаммов вируса гриппа на профиль специфичности NA
45Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах
46 Субстратная специфичность вирусных реассортантов подтипа H5N
47 Субстратная специфичность NA вирусов подтипа H9N
48Роль ак остатков 258, 275, 331, 339, 367, 370, 400 и 431 в функционировании нейраминидазы N
49Специфичность исследованных вирусов гриппа: общие закономерности
410 Вирусы, устойчивые к тамифлю
Введение:
На поверхности вируса гриппа находятся два гликопротеина, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), которые узнают сиалированные углеводные цепи клетки-мишени. Функции этих белков противоположны друг другу: НА связывается с сиалированными рецепторами, a NA отщепляет терминальную сиаловую кислоту с углеводных цепей, то есть разрушает рецептор. Важным условием эффективной репликации вируса гриппа является оптимальное соотношение активностей НА и NA.Известно, что NA необходима вирусу гриппа на стадии отпочковывания созревших вирусных частиц от клеточной поверхности (Wagner el al., 2002).Кроме того, есть экспериментальные доказательства необходимости NA на начальном этапе инфекционного цикла вируса гриппа (Matrosovich et al., 2004).Нейраминидаза вируса гриппа является одной из наиболее охарактеризованных сиалидаз: известна пространственная структура NA нескольких подтипов вируса гриппа А, а также нейраминидазы единственного подтипа вируса гриппа В. Предложен механизм действия фермента (Janakiraman et al., 1994). Много сведений накоплено о структурных особенностях и выявлены общие тенденции эволюции NA вирусов различной природы (Colman et al., 1993).Несмотря на повышенный интерес к NA, ее функциональная активность исследована мало, а специфичность остается практически неизученной. В частности, опубликовано всего несколько работ, в которых была осуществлена попытка определения олигосахаридной специфичности NA. Отсутствие данных связано как с трудоемкостью существующих методов, так и с недоступностью сиалированных олигосахаридов. Без знания субстратной специфичности NA по отношению к природным сиалоолигосахаридам невозможны ни определение роли отдельных участков полипептидной цепи в функционировании NA, ни мониторинг возникновения и распространения новых штаммов вируса гриппа, в частности вирусов, устойчивых к лекарствам-ингибиторам NA, ни понимание механизмов лекарственной устойчивости вирусов гриппа.Цели и задачи исследования.Целью данной кандидатской диссертации являлась разработка нового высокочувствительного метода определения активности и исследования субстратной специфичности NA вируса гриппа, и его применение для изучения олигосахаридной специфичности NA нескольких групп вирусов, в частности: а) природных изолятов вирусов одного подтипа, выделенных от различных хозяев; б) искусственно полученных реассортантов вируса гриппа; в) вирусов, устойчивых к ингибиторам NA; г) NA в составе вирусной частицы в сравнении с тем же ферментом, находящимся в растворе.Кроме того, на основании полученных данных об олигосахаридной специфичности NA предполагалось изучение влияния отдельных аминокислотных замен на функционирование фермента.Новизна полученных результатов.Предложен метод определения специфичности NA, основанный на использовании в качестве ее субстратов набора флуоресцентно-меченых по спейсерной группе сиалоолигосахаридов.С помощью семи субстратов показано, что для нейраминидаз вирусов гриппа, выделенных от различных «хозяев», характерны индивидуальные профили субстратной специфичности.Показано, что восстановление функционального баланса гемагглютинин/нейраминидаза реассортантов вирусов гриппа человека с вирусами птиц, может происходить не только благодаря изменению активности, но также и субстратной специфичности NA.Показано, что замена H274Y (NA), обеспечивающая устойчивость современных вирусов гриппа человека к лекарству тамифлю, не приводит к изменению специфичности NA.Доказано, что функционирование NA зависит от непосредственного окружения фермента, а именно, свойства индивидуального белка отличаются от таковых в составе вирусной частицы.Научно-практическая ценность работы.Разработанный метод определения специфичности NA оказался востребованным в службах эпидемиологического надзора за появлением новых разновидностей вируса гриппа, в частности, опасных для человека птичьих штаммов, а также мутаптных вариантов, устойчивых к тамифлю. Предлагаемый метод уже используется для характеризации новых сезонных штаммов вируса гриппа в центрах контроля и профилактики заболеваний: в США (Centers for Disease Control and Prevention), Атланта) и Германии (Институт им. Роберта Коха, Robert Koch-Institut, Берлин).Кроме того, разработанный метод позволил выявить изменения, происходящие с NA вакцинного варианта вируса гриппа при его инактивации при длительном хранении, что актуально при получении нового поколения противовирусных вакцин (Европейский исследовательский консорциум FLUVACC, FP6).
