Главная » 2014»Сентябрь»30 » Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных
10:11 PM
Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных
Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител
Диссертация
Автор: Чемисова, Ольга Сергеевна
Название: Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител
Справка: Чемисова, Ольга Сергеевна. Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.07 Ростов-на-Дону, 2007 149 c. : 61 07-3/529
Объем: 149 стр.
Информация: Ростов-на-Дону, 2007
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1 ПРИНЦИПЫ СЕРОТИПИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ГЛАВА 2 АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ИЕРСИНИЙ
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
31 Бактериальные штаммы
32 Антигены
33 Клеточные линии
34 Культуральные среды
35 Реактивы и растворы
36 Оборудование и приборы
37 Методы иммуноанализа
371 Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА)
372 Эпитопный анализ
373 Конкурентный ТИФА
374 Сэндвич-ТИФА
375 ДОТ - иммуноанализ (ДИА)
376 Иммуноблот
38 Электрофорез
39 Лабораторные животные
310 Статистические методы
ГЛАВА 4 ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ОТДЕЛЬНЫМ СЕРОВ АРИАНТ AM Ypseudotuberculosis
41 Применение биомоделей определенного генотипа
42 Индукция направленной толерантности при неонатальной иммунизации лабораторных мышей
ГЛАВА 5 ГИБРИДОМЫ - ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ Ypseudotuberculosis
51 Оптимизация условий культивирования гибридом
52 Клонирование и особенности скрининга позитивных клонов
53 Изучение стабильности антителопродуцирующейактивности гибридом
ГЛАВА 6 ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕНОВ ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЮ БАКТЕРИЙ У,pseudotuberculosis НА ОТДЕЛЬНЫЕ СЕРОВАРИАНТЫ
61 Эпитопный анализ
62 Молекулярная организация и природа эпитопов, взаимодействующих с МКА
63 Специфичность МКА и иммунохимические свойства узнаваемых ими компл ементарных л иган д ов
64 Сравнительная иммунореактивность некоторых белков Y'pseudotuberculosis со сходной электрофоретической подвижностью
ГЛАВА 7 ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В ТИФА ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ИЕРСИНИОЗОВ И ДРУГИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
71 Подбор компонентов для конструирования экспериментальной иммуноферментной моноклональной тест-системы
72 Применение экспериментальной иммуноферментной моноклональной тест-системы для иммунохимической характеристики и определения сероваропринадлежности «свежевыделенных» штаммов Ypseudotuberculosis
Введение:
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Псевдотуберкулез привлекает к себе внимание исследователей в связи с ростом заболеваемости (47, 64, 90, 129) и все более широким его распространением (67, 129, 138, 225, 274). Клинические проявления этой инфекции отличаются полиморфизмом и сходны с симптомами целого ряда других заболеваний (129, 225), что значительно затрудняет диагноз, для подтверждения которого необходимы результаты бактериологического и серологического анализов.
Бактериологические методы трудоемки, длительны и малорезультативны. Положительные находки регистрируются в 26-79% случаев во время эпидемических вспышек и в 10-15% случаев при спорадических заболеваниях (129. 162).
Значительно более эффективными являются различные методы серодиагностики: реакция непрямой гемагглютинации (20, 56, 63, 158); реакция торможения непрямой гемагглютинации (84, 127, 159); реакция коагглютинации (18, 81, 161); метод флуоресцирующих антител (19, 34, 35, 36, 57, 137, 159).
В последние годы разработаны иммуноферментные тест-системы, обладающие более высокой чувствительностью, однако диапазон их диап-ioci ическон значимости ограничен определением только одного из серовариантов возбудителя (хотя и наиболее часто встречающегося) (7, 53, 82, 123, 125, 147, 160) или относительно невысокой активностью за счет использования адсорбированных поликлональных антител (147). Из коммерческих препаратов для выявления псевдотуберкулеза в настоящее время нам известен только латексный диагностикум, реализуемый предприятием «Биолот» (Санкт-Петербург). Для серотипирования возбудителя псевдотуберкулеза, имеющего весьма существенное значение для эпидемического надзора и анализа путей передачи инфекции и источника инфицирования, современные тест-системы для этих целей отсутствуют.
Сложности разработки препаратов для диагностики псевдотуберкулеза связаны прежде всего с необходимостью получения новых уточненных научно-обоснованных экспериментальных данных об антигенной структуре Y.pseudotuberculosis с учетом последних достижений иммунологии, иммунохимии, биотехнологии. Проведение таких исследований с получением результатов, имеющих как фундаментальное, так и прикладное значение весьма актуально и возможно лишь с привлечением комплекса современных методических подходов, включающих использование биомоделей определенного генотипа, направленного иммуногенеза, связанного с толерогенным эффектом конкретных антигенов, и гибридомной технологией.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выявление и иммунохимическая характеристика видо- и серовароспецифических антигенов возбудителя псевдотуберкулеза с помощью поли-, моноклональных и моноспецифических антител и экспериментальное обоснование возможности их практического применения.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Разработать эффективные схемы и способы иммунизации биомоделей для получения моноспецифических сывороток к отдельным серовариангам возбудителя псевдотуберкулеза.
2. Получить панель антителопродуцирующих гибридом-продуцентов МКА к видо- и серовароспецифическим антигенам/эпитопам псевдотуберкулезных бактерий, изучить стабильность и особенность пролиферации клеточных линий in vitro и in vivo.
3. На основании результатов анализа продуктов гибридизации определить антигены возбудителя псевдотуберкулеза, обеспечивающие клональное доминирование в иммунном ответе у линейных животных, после введения им микробных взвесей отдельных сероваров ^pseudotuberculosis. 4. С помощью набора разноэпитопных МКА выявить антигены Y.pseudotuberculosis, ответственные за его дифференциацию на отдельные сероварианты, а также изучить особенности их экспрессии бактериями псевдотуберкулеза.
5. С использованием современных методов иммунохимического анализа исследовать природу и молекулярную организацию комплементарных МКА лигандов.
6. На основе МКА сконструировать и апробировать в лабораторных условиях экспериментальную моноклональную иммуноферментную тест-систему для обнаружения и серотипирования Y.pseudotuberculosis.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность манипуляции иммунным ответом биомоделей, позволяющая варьировать специфичность синтезируемых животными антител в заданном направлении по .принципу «управляемого» иммунногенеза при получении антисывороток к отдельным сероварам Y.pseudotuberculosis. Впервые с помощью гибридомной биотехнологии генерирована панель разноэпитопных МКА к видо- и серовароспецифическим детерминантам возбудителя псевдотуберкулеза. Впервые проведен анализ иммунного ответа у лабораторных животных, иммунизированных бактериальными клетками Y.pseudotuberculosis I-VI сероваров, по сравнительному изучению специфической активности поликлональных сингенных антисывороток, полученных с применением различных схем обработки биомоделей, включая неонатальное введение толерогенов, а также клонального потомства спленоцитов мышей BALB/c, иммунных к серологически активным антигенам отдельных серогрупп микроорганизма. Получены приоритетные данные о синтезе бактериями псевдотуберкулеза специфических полипептидов, детерминирующих видо- и сероваропринадлежность штаммов Y.pseudotuberculosis, имеющие важное теоретико-экспериментальное значение для совершенствования внутривидовой классификации псевдотуберкулезных микробов и их дифференциации с другими патогенными иерсиниями. Новыми являются сведения о взаимосвязи серологической иммунореактивности термостабильных О-антигенов возбудителя псевдотуберкулеза с их белковыми компонентами, а также пол и д етерми н a tit н о vi характере специфичности псевдотуберкулезных микробов.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ заключается в конструировании экспериментальных моноклональных иммуноферментных тестсистем для идентификации и серотипирования штаммов Y'.pseudotuberculosis. Получен оригинальный набор стабильных гибридных клеточных линий, секретирующих МКА к видо- и серовароспецифическим эпитопам Y.pseudotuberculosis, которые могут быть использованы в качестве инструмента при изучении структурно-функциональной и молекулярной организации серологически активных антигенов Y.pseudotuberculosis.
Впервые с помощью индукции серологической толерантности к неспецифическим для псевдотуберкулезных бактерий эпитопам получены поликлональные моноспецифические сыворотки к отдельным серовариантам возбудителя псевдотуберкулеза, не нуждающиеся в проведении дополнительной адсорбции, а указанный методический прием может быть перспективным для изучения иммуно- и патогенеза псевдотуберкулезной инфекции.
Оптимизированы отдельные этапы технологии создания антителопродуцирующих гибридом, позволяющие значительно увеличить количество выживающих клонов-продуцентов МКА.
По материалам диссертации составлены «Методические рекомендации «Получение моноклональных антител для серотипирования штаммов Yersinia pseudotuberculosis в иммуноферментном анализе», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (Протокол № 6 от 06.07.2001 г.) и утверждены директором института (06.07.2001 г.).
Материалы диссертации используются при чтении лекций по иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб».
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Получение поликлональных моноспецифических антисывороток, взаимодействующих в ТИФА с отдельными (II, III, IV) сероварами Y.pseudotuberculosis, возможно при неонатальной обработке по определенной схеме биомоделей микробными взвесями Y.pestis EV.
2. Комплементарные МКА видо- и серовароспецифические секвенциальные (линейные) эпитопы возбудителя псевдотуберкулеза локализованы на термостабильных сложноорганизованных полипептидах, которые имеют преимущественно термоиндуцибельный характер синтеза и представляют собой белковые компоненты термостабильных О-антигенов, детерминируя их серологическую иммунореактивность.
3. Внутривидовая классификация, а также дифференциация Y'.pseudotuberculosis от других патогенных иерсиний, возможна на основе способности бактерий синтезировать серовароспецифические белки.
4. Антигены белковой природы, экспрессируемые разными сероварами бактерий псевдотуберкулеза и обладающие сходной электрофоретической подвижностью могут быть иммунохимически неидентичными.
5. Сконструированные на основе МКА экспериментальные иммуноферментные тест-системы позволяют идентифицировать от 7,6-104 до 3,Ы0Э - 6Л-103 м.кл./мл штаммов Y.pseudotuberculosis, в зависимости от сероваропринадлежности, и проводить их серотипирование.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на:
• Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ, Киров, 1998 г.;
• Международном симпозиуме по стратегии в борьбе с чумой, Китайская Народная Республика, Байчен, 1999 г.;
• Российской научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения член-корр. АМН СССР профессора Н.Р. Иванова. Саратов.
• Международной конференции «Современная этиотропная терапия инфекционных болезней человека», Гомель, Республика Беларусь, 2000 г.;
• Научно-практической конференции, посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной службе,
• Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции МЗ РФ, Астрахань, 2001 г.;
• итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2000, 2001, 2002 г.
Настоящая работа поддержана грантами РФФИ «Теоретико-экспериментальное исследование структурно-функциональной организации и иммунобиологических свойств видо- и серовароспецифических детерминантов Yersinia pseudotuberculosis и их вклад в индукцию иммунного ответа» № 01-04-48048 и № 02-04-06637.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 290 источников, из них зарубежных - 124. Объем диссертации составляет 158 страниц машинописи, включая 27 рисунков и 12 таблиц.
